幸运飞艇的加减公式

产品搜索
产品目录
技术文章
教您如何正确冷冻保存ATCC细胞
点击次数:8 发布时间:2020-02-11
   教您如何正确冷冻保存ATCC细胞
  一、ATCC细胞冷冻保存
  1、材料:
  生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)。
  2、冷冻保存方法:
  (1)传统方法:冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16~18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
  (2)ATCC细胞程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
  3、步骤:
  (1)冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。
  (2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):将DMSO加入新鲜培养基中,zui后浓度为5~10%,混合均匀,置于室温下待用。
  (3)依细胞继代培养之操作,收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
  (4)离心,去除上清液,加入适量冷冻保存溶液,使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。
  4、注意事项:
  (1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且ATCC细胞存活率高之状态,约为80–90%致密度。
  (2)冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
  (3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP flon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。
  (4)冷冻保存之细胞浓度:
  ①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml
  ②hybridoma:1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后si去。
  ③adherent tumor lines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
  ④other suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte须至少5×106cells/ml。
  (5)ATCC细胞冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。
  二、冷冻细胞活化
  1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。
  2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
  3、材料 :37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器 。
  4、步骤:
  (1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止ATCC细胞冷冻管可能爆裂之伤害。
  (2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。
  (3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。
  (4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
  (5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
  (6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。
  (7)ATCC细胞若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。
 
联系人:周雯
座机:
86-021-55825868
400-788-3317
手机:
18930233920
点击这里给我发消息

推荐收藏该企业网站
扫一扫访问手机站
访问手机站